数字PCR是近年来迅速发展起来的一种定量分析技术。与传统定量PCR技术不同的是数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值(CT)进行定量,不受扩增效率的影响,也不必采用看家基因和标准曲线,具有很好的准确度和重现性,可以实现定量分析。迄今为止,已有Fluidigm、Bio-Rad等相继推出了数字PCR仪器,已经在单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。
PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的持异结合。
整个扩增过程分三步:
1、变性:使DNA双链解离,形成两条单链;
2、退火:温度下降后模板DNA与引物按氨碱基配对原则互补结合,也可能存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度、结构简单等特点,结合主要发生在模板与引物之间;
3、延伸:在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下,从引物的3"端开始,结合单核苷酸,形成与模板链互补的新DNA链。上述几步为一个循环,从理论上讲,每经过1个循环,样本中的DNA应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板。第2个循环开始后,模板链增加—倍。经过25—30个循环后DNA可扩增10的6次方至9次方倍。